杭州浩克生物一、項(xiàng)目介紹
EMSA 是一種用于研究核酸和蛋白質(zhì)之間相互作用的技 術(shù)，適用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，主要是 驗(yàn)證蛋白質(zhì)與特定核酸序列的結(jié)合特性，從而間接推斷已知蛋 白質(zhì)的靶序列或已知序列的結(jié)合蛋白質(zhì)分子。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1、 蛋白的提取
漿蛋白核蛋白提取（細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒）
1.1 準(zhǔn)備溶液：室溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細(xì)胞核蛋白抽提試劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
1.2 對(duì)于貼壁細(xì)胞：用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
1.3 對(duì)于懸浮細(xì)胞：用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
1.4 對(duì)于新鮮組織：
1.4.1 把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B(例如200微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至最終濃度為1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。
1.4.2 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。
1.4.3 4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。(吸上清時(shí)千萬(wàn)不要觸及沉淀。)
1.4.4 對(duì)于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細(xì)胞還沒(méi)有破碎。
1.4.5 每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。(對(duì)于二百萬(wàn)Hela細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)
1.4.6 最高速劇烈Vortex 5秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開。(如果細(xì)胞沉淀沒(méi)有完全懸浮并分散開，可以適當(dāng)延長(zhǎng)vortex時(shí)間。)
1.4.7 冰浴10-15分鐘。
1.4.8 加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。最高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。
1.4.9 最高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。
1.4.10 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢詢龃?。(千萬(wàn)不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。)
1.4.11 對(duì)于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會(huì)帶來(lái)細(xì)胞漿蛋白的污染。)
1.4.12 最高速劇烈Vortex 15-30秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。
1.4.13 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。
1.5 每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。(對(duì)于二百萬(wàn)Hela細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)
1.6 最高速劇烈Vortex 5秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開。(如果細(xì)胞沉淀沒(méi)有完全懸浮并分散開，可以適當(dāng)延長(zhǎng)vortex時(shí)間。)
1.7 冰浴10-15分鐘。
1.8 加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。最高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。
1.9 最高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。
1.10 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以凍存。(千萬(wàn)不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。)
1.11 對(duì)于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會(huì)帶來(lái)細(xì)胞漿蛋白的污染。)
1.12 最高速劇烈Vortex 15-30秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。
1.13 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。
1.14 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢?70℃凍存。
2、 制膠 （1.5mm膠，大約30分鐘膠會(huì)凝）
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試劑 |
濃度5.5％ |
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H2O ml |
7.50 |
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10*TBE ul |
500 |
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40％丙烯酰胺 ml |
1.50 |
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50%甘油 ul |
500 |
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10％AP ul |
50 |
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TEMED ul |
10 |
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總體積 ml |
10 |
待膠完全凝固后120v預(yù)電泳1h，緩沖液用預(yù)冷的0.5×TBE。
3、 蛋白與探針?lè)磻?yīng)(注：蛋白濃度1 ug/uL ,上樣體積2 uL)
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試劑名稱 |
陰性對(duì)照 |
樣品組 |
冷競(jìng)爭(zhēng) |
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10×binding buffer |
2 |
2 |
2 |
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1ug/ul poly（dl.dc） |
1 |
1 |
1 |
|
50％glycerol |
1 |
1 |
1 |
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1%NP-40 |
1 |
1 |
1 |
|
100m M Mgcl |
1 |
1 |
1 |
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200m M EDTA |
1 |
1 |
1 |
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Protein |
– |
+ |
+ |
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標(biāo)記探針（200 fmol） |
+ |
+ |
+ |
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未標(biāo)記探針(40 pmol) |
0 |
0 |
+ |
|
H2O |
+ |
+ |
+ |
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總體積 |
20 |
20 |
20 |
混合后室溫放置20分鐘。
4、 上樣
預(yù)電泳完后馬上更換預(yù)冷的電泳緩沖液，加5ul的5×上樣緩沖液到樣品混合液中，馬上上樣電泳。180v ，60min。
5、 電轉(zhuǎn)移
將帶正電的尼龍膜放入0.5×TBE中平衡10分鐘。待電泳完成后將加有樣品的整塊膠取下電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜緩沖液為預(yù)冷的0.5×TBE。300m A 30分鐘。
6、 交聯(lián)
轉(zhuǎn)膜完成后將膜取出，放在一張干凈的濾紙上，做好標(biāo)記。于紫外燈下20cm處作用20分鐘。
7、 封閉
將交聯(lián)完成的尼龍膜取出放入洗凈的孵育槽，用封閉液封閉20分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。(慢搖)。
8、 抗體反應(yīng)
倒掉封閉液。用封閉液將抗體稀釋300倍后，與膜完全作用30分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。(慢搖).
9、 洗脫
用1×的洗脫液清洗3次,每次5分鐘。搖床速度加大。
10、平衡
用平衡液平衡5分鐘。
11、ECL發(fā)光檢測(cè)
12、圖像分析（灰度比分析結(jié)果見EXCEl表格）
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